Controle de dopagem de anabolizantes: o perfil esteroidal e suas regulações

Controle de dopagem de anabolizantes: o perfil esteroidal e suas regulações



Control of doping with anabolic agents: the steroid profile and its regulations





Marlice Aparecida Sipoli MarquesI, II; Henrique Marcelo Gualberto PereiraI; Francisco Radler de Aquino NetoI

ILABDOP, Instituto de Química, Departamento de Química Orgânica, Universidade Federal do Rio de Janeiro
IILABDOP, Instituto de Química, Departamento de Química Analítica, Universidade Federal do Rio de Janeiro




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RESUMO

O conceito de perfil esteroidal é discutido neste artigo. As principais vias biossintéticas são apresentadas. A importância do monitoramento do perfil esteroidal é demonstrada dentro da clínica médica e da medicina esportiva. Parâmetros da literatura para a identificação de dopagem por esteróides endógenos são apresentados, assim como os fatores que acarretam alterações no perfil esteroidal normal. É dada atenção especial a essa última abordagem.

Palavras-chave: Esteróides. Perfil. Biossíntese. Dopagem.


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ABSTRACT

The concept of steroid profile is discussed in this paper. The main metabolic routes are presented. The importance of evaluating steroid profiles is demonstrated, with special attention to clinical medicine and sports. Parameters used in the literature for doping control of endogenous steroids are briefly evaluated, as well as the factors responsible for alterations in the normal steroid profile. Special focus is turned to the latter approach.

Key words: Steroids. Profile. Biosynthesis. Doping.


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DEFINIÇÃO DE PERFIL ESTEROIDAL

O termo perfil esteroidal foi empregado pela primeira vez em meados da década de 60. Em 1968, Horning1 publicou um artigo sobre o perfil esteroidal baseado na análise cromatográfica de esteróides neutros.

De acordo com o dicionário Webster2, a palavra perfil (profile) originou-se do latim em 1656 e pode ser definida como um conjunto de dados que, representados de forma quantitativa, na forma de gráfico, mostra a tendência do parâmetro avaliado, independente da técnica de detecção2. Alguns pesquisadores podem inferir que essa definição é muito ampla, já que, erroneamente, pode-se pensar que para estabelecer o perfil esteroidal é necessário coletar todos os dados disponíveis no cromatograma relativo aos esteróides detectados3.



BIOSSÍNTESE E REGULAÇÃO DE ESTERÓIDES

Os hormônios corticossupra-renais de ocorrência natural consistem em moléculas de esteróides sintetizadas e liberadas pelo córtex supra-renal. A secreção dos esteróides corticossupra-renais é controlada pela liberação hipofisária de corticotropina (ACTH). O córtex supra-renal libera grande número de esteróides na circulação. Alguns possuem atividade biológica mínima e atuam primariamente como precursores, enquanto outros ainda não tiveram sua função estabelecida. Os esteróides hormonais podem ser classificados em esteróides que possuem efeitos importantes sobre o metabolismo intermediário (glicocorticosteróides), esteróides que exercem principalmente atividade de retenção de sal (mineralocorticosteróides) e os queexibem atividade estrogênica ou androgênica, os quais são os objetivos deste trabalho.

A figura 1 ilustra, de forma simplificada, a biossíntese e o metabolismo dos esteróides endógenos no organismo humano1,3-6.



HORMÔNIO ADRENOCORTICOTRÓPICO (ACTH): REGULAÇÃO NA BIOSSÍNTESE E METABOLISMO DOS ESTERÓIDES ENDÓGENOS

O ACTH é um hormônio que estimula o córtex da supra-renal a sintetizar cortisol (glicocorticosteróide), corticosterona, aldosterona (mineralocorticosteróide) e várias substâncias androgênicas fracas (figura 2)4,6. A formação da pregnenolona através da clivagem oxidativa da cadeia lateral do colesterol é o principal processo da esteroidogênese regulada pelo ACTH (figuras 1 e 2). Essa etapa é limitadora de taxa na seqüência de reações que levam à formação de hormônios esteroidais adrenais. Além disso, o ACTH aumenta a ligação do colesterol ao citocromo P4507,8. Esses fatos, juntamente com a evidência de que a disponibilidade de colesterol é o fator que limita a extensão da reação de clivagem do colesterol na mitocôndria intacta9, sugerem que o ACTH, via AMP cíclico, estimula a reação inicial de esteroidogênese do mesmo, tornando o substrato disponível quando há maior concentração da enzima dentro das mitocôndrias. O ACTH também atua aumentando a disponibilidade do colesterol, estimulando sua captação de lipoproteínas plasmáticas10.








Do ponto de vista quantitativo, a desidroepiandrosterona (DHEA) é o principal androgênio, visto que são secretados cerca de 20mg por dia (em parte na forma de sulfato). Todavia, tanto a DHEA como a androstenodiona são androgênios muito fracos11.

Nos seres humanos a testosterona (T) é o androgênio mais importante secretado pelos testículos (figuras 1 e 3). As vias de síntese da T nos testículos são semelhantes às descritas para a supra-renal. No homem são produzidos diariamente cerca de 8mg de T. Cerca de 95% pelas células de Leydig e apenas 5% pelas supra-renais. O testículo também secreta pequenas quantidades de outro androgênio potente, a diidrosterona (DHT), bem como androstenodiona (AEDION) e desidroepiandrosterona (DHEA), que são androgênios fracos12-14. A principal via de degradação da T nos seres humanos encontra-se ilustrada na figura 1. No fígado, a redução da ligação dupla e cetona do anel A, conforme observado com outros esteróides com configuração D4-cetona, resulta na produção de substâncias inativas, como androsterona (A) e etiocolanolona (E), que são posteriormente conjugadas e excretadas na urina15.



ESTERÓIDES ENDÓGENOS DE BIOSSÍNTESE DESCONHECIDA

Norandrosterona (NA)

A nandrolona (ND) é um dos anabolizantes mais encontrados em dopagem de atletas nos últimos anos16,17. No organismo humano a ND é metabolizada a norandrosterona (NA) e noretiocolanolona (NE, figura 4)18-21, que são excretadas na urina na forma glicuconjugada. A administração dos precursores da ND, como a norandrostenodiona (NDA) e norandrostenodiol (NDOL), também leva à formação dos mesmos metabólitos (NA e NE, figura 5)17,20.















O principal metabólito da ND é a NA, apresentando a maior concentração na urina e a mais longa excreção (figura 6). A fim de excluir a possibilidade de produção endógena22-29, o Comitê Olímpico Internacional (COI) estipulou concentração de corte (cut off) de 2ng/mL e 5ng/mL para homens e mulheres, respectivamente, a ser considerada como um positivo do uso de ND, já que a mesma foi caracterizada com estudos em animais22-24 e humanos25-29. Abaixo dessas concentrações, até o presente momento, não se sabe a via de biossíntese endógena desse 19-nor-esteróide.








IMPORTÂNCIA DO MONITORAMENTO DO PERFIL ESTEROIDAL

Os esteróides de interesse no estabelecimento das condições normais e fisiopatológicas do homem podem ser reunidos em vários grupos distintos (tabela 1)1,3-6. Os hormônios esteroidais podem ser classificados em precursores e metabólitos. Os percussores e alguns dos seus metabólitos asseguram a função biológica (hormonal), sendo que a determinação desses contribuiria na avaliação a função endócrina. Já a determinação dos principais metabólitos auxilia na elucidação dos erros biossintéticos.

Os esteróides precursores são biossintetizados nas glândulas e lançados na corrente sanguínea. Os metabólitos terminais são excretados na urina e bile, na forma livre e/ou conjugada3,30.

Shackleton31 e Donike et al.32 foram os primeiros a reportar na literatura a elucidação do perfil esteroidal com o intuito de caracterizar dopagem em atletas pelo uso indevido de esteróides endógenos. Os autores descreveram as alterações provocadas nas quantidades relativas de um esteróide ou de seus diferentes metabólitos após a administração de alguns esteróides endógenos. Atualmente, distúrbios nessas razões são amplamente empregados na caracterização de dopagem por esteróides endógenos.



ESTERÓIDES ANABÓLICOS E GLICOCORTICOSTERÓIDES

Esteróides anabólicos

Esteróides anabólicos (EA) são substâncias relacionadas ao hormônio sexual masculino, a T (figuras 1 e 3)33,34. Esse hormônio exerce diversos efeitos no homem, inclusive o de aumentar a massa muscular e o peso corpóreo.

Nos esportes, os EA são administrados em atletas justamente com o intuito de aumentar a massa muscular e, conseqüentemente, garantir melhora no desempenho. O uso ilícito de EA iniciou-se na década de 50, entre levantadores de peso e fisiculturistas, tendo-se alastrado para outras modalidades esportivas. Devido a razões de ordem ética e aos efeitos nocivos à saúde, essas substâncias tiveram o uso proibido pelo COI a partir de 1976, na Olimpíada de Montreal, onde foi realizado pela primeira vez o controle de anabolizantes. Seis atletas foram punidos pelo uso indevido35.

A figura 7 permite visualizar a proporção relativa do uso dessas substâncias em relação às demais classes farmacológicas de uso proibido para atletas36, nos últimos anos. Uma estatística do próprio COI (figura 8), no decorrer do ano de 1993, permitiu constatar que o esteróide mais empregado na dopagem de atletas era a T36.















Glicocorticosteróides

Glicocorticosteróides são substâncias de estrutura química relacionada ao hormônio cortisol conhecidas como esteróides adrenais. O cortisol exerce um papel importante no equilíbrio eletrolítico e no metabolismo de carboidratos, proteínas e lipídeos e possui potente efeito antiinflamatório37.



PARÂMETROS DA LITERATURA PARA A IDENTIFICAÇÃO DE DOPAGEM POR ESTERÓIDES ENDÓGENOS

A confirmação de esteróides endógenos em dopagem de atletas é, atualmente, um dos maiores problemas do controle. Por isso, é necessário encontrar critérios para discriminar o uso exógeno da produção endógena. Para tanto, utilizam-se, freqüentemente, parâmetros de referência (baseados na população européia)12,31,32,38-40 descritos a seguir.

Desidroepiandrosterona (DHEA)

Após a administração de DHEA (figura 1) ocorre aumento na concentração da A, E, 3a,5a-androstenodiol (3a,5a-DIOL) e DHEA. Esses são os parâmetros mais estáveis na avaliação da administração exógena de DHEA (se a dopagem for recente). Uma suspeita de positivo ocorre quando a concentração estiver acima do limite superior da faixa de referência dos valores normais da população em estudo, ou seja, 10ng/ml31,41-43.

Diidrotestosterona (DHT)

A administração exógena de DHT, que é o metabólito ativo da T, leva a aumento da excreção da própria DHT e de seus metabólitos (figuras 1 e 8)12,32,42,43. Entretanto, AEDION e epitestosterona (EpiT) não são influenciadas. Conseqüentemente, o abuso da aplicação de DHT pode ser caracterizado pelo aumento das razões entre a DHT e alguns esteróides endógenos (tabela 2 e figura 3).








5a-androstanodiona (ADION)

Após a administração de ADION, o perfil esteroidal assemelha-se ao observado quando se administra DHT (figura 8, tabela 3). A única diferença é que o aumento observado nos valores de concentração dos metabólitos da DHT é inferior aos valores obtidos após a administração de DHT, porém superior aos valores normais estipulados para a população em estudo. Não se observa aumento na excreção da 5a-androstanodiona na urina após a sua administração12.

Androsterona (A)

Administração de A leva a aumento na sua própria concentração excretada, assim como na do 5a,3a-DIOL. Não se observam modificações significativas nas concentrações de T e EpiT formadas12.

Androstenodiona (AEDION)

A administração exógena de AEDION pode ser caracterizada por aumento nas concentrações de A, E, T e, conseqüentemente, na razão T/EpiT9,43-45. Além da presença dos metabólitos 6a-OH-androstenodiona, 6b-OH-androsterona, 6b-OH-etiocolanolona e 6b-OH-epiandrosterona.

Testosterona (T)

A T e a EpiT são os únicos endógenos que possuem um critério estabelecido pelas confederações esportivas e pelo COI. Uma razão T/EpiT > 6 na urina de um atleta é considerada como dopagem, caso não seja comprovado que o mesmo possua as suas funções fisiológicas e/ou endocrinológicas alteradas46-52.

Epitestosterona (EpiT)

A possível administração simultânea de T e EpiT para fraudar o critério anterior levou tanto o COI como as confederações esportivas à proposição de positivo de EpiT, caso a mesma seja encontrada em uma concentração acima de 200ng/mL16,27.

5-androstenodiol (AEDIOL)

A administração exógena de AEDIOL (figuras 1 e 9), segundo Schänzer et al., leva a aumento na concentração de testosterona e seus metabólitos42,44,45,50,51,53.

Nandrolona (ND)

Conforme já mencionado, o COI estabeleceu as concentrações de corte de 2ng/mL e 5ng/mL para homens e mulheres, respectivamente, como parâmetro para a confirmação de administração exógena de ND27. O problema dessa estratégia é mais complexo para as mulheres, em que uma série de parâmetros deve ser considerada. Por exemplo, é perfeitamente possível encontrar o metabólito NA na urina de mulheres grávidas, já que a ND está presente no fluido do folículo ovariano e na placenta durante a gravidez28,51,54-56. Nesses casos, além da concentração de corte, recomenda-se a realização da dosagem de gonadotropina coriônica humana (hCG), de modo a determinar a ocorrência ou não de gestação. Também é comum a observação da presença de NA em urina de mulheres que fazem uso do anticoncepcional norestisterona (noresteróide)27. Porém, nesse caso, a presença dos outros metabólitos provenientes da noretisterona permite excluir a possibilidade de um falso-positivo por ND.



FATORES QUE ACARRETAM ALTERAÇÕES NO PERFIL ESTEROIDAL NORMAL

Conforme descrito acima, alguns parâmetros interferem no perfil esteroidal normal31,37,57-60.

Efeito de administração exógena de esteróides endógenos

Phillips (1996)60 estudou a relação, no soro, entre DHEA-S, AEDION e hormônios sexuais do homem e da mulher (figuras 1 e 2). O autor concluiu que, no homem, o nível de DHEA-S não pode ser correlacionado com o de testostosterona-glicuconjugada (T-G) ou testosterona-livre (T-L), mas é correlacionado, fortemente, com o da AEDION. Na mulher, a concentração de DHEA-S está relacionada não somente com a AEDION, mas também com a T e T-L. A DHEA-S não mostrou qualquer correlação com o estradiol e a insulina, tanto no homem quanto na mulher. A falta de correlação entre DHEA-S e T, no homem, é consistente com a biossíntese independente desses hormônios pela glândula adrenal e testículos, respectivamente.

Kazlauskas (1998)41 estudou o efeito da administração de DHEA (100 e 200mg, na forma de ésteres) por via oral, em indivíduo saudável. O autor concluiu que a concentração de DHEA aumentava duas-três vezes em relação ao valor normal apenas por um período curto (0-6 horas). O autor constatou também que havia aumento significativo na razão A/E e 3a,5a-androstenodiol/3a,5b-androstenodiol (3a,5a-TDIOL/3a,5b-TDIOL). A razão T/EpiT foi afetada apenas nas primeiras 10 horas após a administração, mas não excedeu significativamente os valores normais. Caso a amostra seja coletada após um período de 50 horas da administração da DHEA, esses valores podem ter retornado aos normais ou ainda algumas razões podem estar até invertidas, como, por exemplo, A/E. Portanto, o tempo em que a amostra foi coletada após a administração do fármaco é de fundamental importância na interpretação dos resultados. Os autores concluem ainda que, no caso de um positivo de DHEA, devem-se comparar os dados obtidos com os valores de referência da população em estudo41.

Efeito da administração de esteróides exógenos

A administração de esteróides exógenos diminui a secreção de esteróides endógenos por um mecanismo de retroalimentação negativa4,37. Estudos comprovam que a metandienona (um anabolizantes sintético) leva a diminuição na excreção de esteróides endógenos46,61. O uso prolongado de estanozolol leva a diminuição da razão A/E46,61.

Administração de álcool

A ingestão de álcool, em altas doses, pode elevar a razão T/EpiT e diminuir a razão A/T através do aumento da excreção de T-conjugada e decréscimo na excreção de androsterona-conjugada. Essas alterações estão relacionadas à presença de etanol na urina61.

Administração de probenicida e diuréticos

A administração de probenecida reduz a excreção dos esteróides conjugados. As razões entre os esteróides não se modificam. Esse efeito é devido à inibição competitiva com os ácidos orgânicos pelos mecanismos de transporte ativos nos túbulos proximais dos rins32.

Ao contrário da probenecida, os diuréticos não reduzem a excreção de esteróides; essas substâncias aumentam o fluxo de urina e, conseqüentemente, reduzem a concentração dos esteróides nessa excreta.

Administração de finasterida

A administração de finasterida leva à inibição da atividade da enzima 5a-redutase, conseqüentemente, a diminuição considerável na razão A/E, na razão 3a,5a-DIOL/3a,5b-DIOL e na concentração de DHT49.

Efeito do estresse físico na biossíntese e metabolismo de esteróides endógenos

É de conhecimento geral que a produção de hormônios pelas gônadas e pela supra-renal é controlada pelo eixo hipotálamo-pituitária (figura 2). Portanto, é de esperar que o estresse físico possa alterar não só a produção de ACTH, como também a do hormônio luteinizante (LH)4,37.

Yap et al. (1996)39 avaliaram os efeitos do estado emocional, neural e hormonal sobre o perfil de esteróides endógenos, após o estresse físico. Para tanto, os autores realizaram um estudo sistemático, em que os atletas foram divididos em três grupos, sendo um quarto grupo usado como controle. Com exceção dos grupos controles, os atletas foram submetidos a condições predeterminadas de treinamento, em que os parâmetros de umidade, ventilação, capacidade respiratória, consumo de oxigênio e treinamento intensivo foram avaliados.

Os autores avaliaram principalmente o efeito do estresse físico sobre o aumento do LH e da T. A análise foi realizada por cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas (CG-EM). Uma avaliação das concentrações de T (figura 5) e LH e das razões de T/LH comprovou que, apesar de o estresse estimular a produção do LH, a concentração de T não era alterada significativamente quando comparada com os dados obtidos com o grupo controle. Conseqüentemente, ocorria diminuição da razão T/LH. Os autores destacam ainda a importância de realizar esse tipo de estudo em amostras de urinas coletadas em intervalos de tempo determinados, não devendo ser colhida a urina diurna, pois inversões nessas razões podem ser observadas.

Aumento do ACTH, por qualquer causa (estresse ou outros estímulos), pode levar à ocorrência de aumento de todos os precursores produzidos nas adrenais, tais como pregnenolona ® 17OH-pregnenolona ® DHEA (hormônios adrenais, figura 1). De acordo com a figura 2, tais fatores, além de aumento no ACTH, podem também levar a acréscimo na liberação do LH. Esse fato irá refletir-se em aumento da secreção dos hormônios adrenais e gônadas.

Resumindo, os parâmetros baseados na distribuição do perfil esteroidal de uma dada população são muito estáveis e devem ser empregados como valores de referência na confirmação de dopagem pelo atleta com esteróides endógenos3,32,46-49,60,61, com exceção da nandrolona. Esses parâmetros podem ser influenciados, contudo, pela administração de esteróides endógenos ao atleta, bem como de alguns esteróides exógenos ou fármacos como finasterida, tamoxifeno, probenecida, diclofenaco, diuréticos, etanol, trimetropima, entre outros. Atividade bacteriana também pode causar alterações desses parâmetros3,62. Portanto, técnicas de detecção que permitam a discriminação tanto da administração exógena de endógenos e a influencia desses parâmetros no perfil esteroidal normal viriam auxiliar na confirmação do abuso de esteróides endógenos63-69. Atualmente, uma nova abordagem no controle dessas substâncias vem sendo empregada. O enfoque consiste no emprego da CG-EM convencional para triagem dos supostos positivos e posterior confirmação por cromatografia gasosa/combustão acoplada à espectrometria de massas por razão isotópica (CG/C/EMRI).




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